앞서 알아보았던 PCR의 원리에서 프라이머라는 걸 알았죠
오늘은 이 프라이머의 역할에 대해 조금 더 자세히 알아볼게요
핵산은 상보적인 서열끼리 상보적 결합으로 이중가닥을 형성하고 있고, PCR을 했을때 이 가닥중 한 부분에 프라이머가 결합해서 신장되는 과정을 거쳐 하나의 이중가닥은 두개의 이중가닥으로 늘어나게 되는거죠
여기서 잠깐!
여기 용어를 한눈에 볼 수 있는 사진을 첨부하니 용어 헷갈리기 없기!
사진은 지식백과의 사진을 참고했습니다~
핵산의 종류는 DNA와 RNA 두가지 유형이 있고, 기본적으로 DNA는 이중결합, RNA는 단일결합으로 이루어져있어요.
그래서 PCR을 할때 DNA의 경우에는 DNA자체를 바로 PCR해도 되지만 RNA의 경우에는 단일가닥이기 때문에 RNA를 cDNA라고 하는 상보적 DNA로 만들어준 후 PCR을 진행해야 해요.
그 이유는 PCR원리를 보면 알 수 있겠죠? 아직 보지 못했다면 제 블로그에도 원리를 올려두었으니 참고해주세요~
다시 본론으로 들어와서!
프라이머에 대해 알아볼게요
DNA의 경우 A,T,G,C 염기가 있죠
DNA는 이렇게 이중가닥으로 구성되있구요
PCR에서 denaturation(변성)단계를 거친 후, 이 이중가닥이 풀리게 되면 프라이머가 붙게 된다고 했죠?
예를 들어볼게요
이 DNA서열을 증폭시키고 싶다고 생각해봅시다.
5'-ATTGTGCATATTCGCGCCATGATAATTCGTATG-3'
이부분에서 우리는
이렇게 디자인할 수 있어요
자 이렇게 디자인해서 PCR에 사용하면
첫번째 cycle에서 reverse 프라이머가 template서열에 먼저 붙어서 서열의 신장이 일어나요
요렇게요!
5'-ATTGTGCATATTCGCGCCATGATAATTCGTATG-3'
3'-TAACACGTATAAGCGCGGTACTATTAAGCATAC-5'
그럼 이제 또 두번째 cycle이 시작되서 이중가닥이 벌어지게 되면 아래의 서열과 Forward 프라이머가 붙을 수 있게 되요 reverse프라이머는 위의 서열과 또 결합하게 되구요
결국 첫번째 cycle은 reverse 프라이머가 결합 두번째 부터 끝나는 cycle까지 forward, reverse 프라이머가 결합하는 순서로 신장이 진행돼요
이 과정을 거쳐 원하는 부분만 마구마구 증폭하게 되는거죠
이 DNA 서열을 내가 실험에 사용하고 싶거나 샘플안의 DNA중에서 원하는 DNA가 존재하는지 알고 싶다면 원하는 부위를 위와 같이 디자인해서 실험에 사용하면 돼요
그렇다고 무조건 앞과 뒤를 디자인하면 되느냐!
노노
고려해야 할 점들이 많아요
A와 T는 두개의 수소결합, G와 C는 세개의 수소결합이 일어나는거 저번시간에 언급했었는데 세개의 수소결합은 두개의 수소결합보다 더 강한 결합이에요 따라서 각 염기들이 결합할때 필요한 에너지가 다른거죠
1
G와 C의 비율을 조절해서 PCR할때 프라이머의 결합 온도를 조절해야 합니다.
일반적으로 G+C 비율이 50%정도인 게 좋아요. 저는 보통 55도~ 60도 사이로 프라이머를 디자인해요
A와 T는 두개의 수소결합, G와 C는 세개의 수소결합이 일어나는거 저번시간에 언급했었는데 세개의 수소결합은 두개의 수소결합보다 더 강한 결합이에요 따라서 각 염기들이 결합할때 필요한 에너지가 다른거죠
Tm = 4℃ x (G+C의 수) + 2℃ x (A+T의 수)
계산식이긴한데,, 알아만 두세요 걍 프로그램 돌리면 됩니다.
2
Forward와 Reverse프라이머의 Tm(온도)가 비슷하게 디자인해요.
말그대로 Forward프라이머가 56도정도였다 하면 Reverse도 그정도인 57-58도 정도로 디자인해요
그리고 PCR을 할때는 높은 온도에서 2도 정도 낮춘 위의 경우에는 56도로 PCR을 진행해서 결과를 확인해봅니다.
너무 낮은 온도로 PCR을 해버리면 mispriming이 일어나 PCR반응의 특이성이 낮아질 수 있으니 조심!
3
프라이머의 길이는 15-30개의 염기가 적당해요 프로그램을 사용해서 염기의 Tm을 확인해보면서 15-30개 사이로 디자인해요
저는 20-25정도? 길이로 디자인한답니다.
4
실험에 따라 증폭될 사이즈도 달라지니까 프라이머 디자인시 고려되야해요
진단을 위한 경우라면 보통 증폭되는 사이즈를 200bp내외로 하기 때문에 프라이머를 디자인할때 200bp내외가 증폭되게 디자인해야해요
그외에도 AT-rich, 프라이머 농도, 프라이머끼리의 dimer형성, 프라이머 내의 2차구조등의 고려사항이 있지만 일반적으로 디자인할때 제일 기본이 되는건 저렇게 네가지 고려사항이에요
저렇게 네가지로 고려했을때 안되면 다른 고려사항도 확인해보면서 디자인을 수정해요
솔직히 될놈될이라고 될애들은 개떡같이 디자인해도 찰떡같이 되고 그래요
하하
프라이머 디자인해서 프라이머주문하는 업체 사이트에서 정보 입력하면 옆에 Tm확인할 수 있어요 그걸보고 온도 55-60정도로 정하면 돼요 ㅎㅎ
다들 프라이머 디자인 한번에 성공하시고 실험도 한번에 결과 나오시길 바래요
화이팅!
이상 뚜동이의 실험정보 였습니다~
출처: https://terms.naver.com/entry.naver?docId=5568800&cid=61233&categoryId=61233
'실험 정보' 카테고리의 다른 글
| [실험 정보] Real-time PCR- Part 2 (Taqman probe 원리, SYBR green과의 차이점, 디자인시 주의사항) (0) | 2022.04.16 |
|---|---|
| [실험 정보] Real-time PCR- Part 1 (실험의 특징과 SYBR Green원리) (3) | 2022.04.09 |
| [실험 정보] 피펫 사용법 A 부터 Z까지(주의사항포함) (3) | 2022.03.28 |
| [실험 정보] AUTOCLAVE, 다 멸균시켜버리겠어(오토클레이브 작동법, 주의 사항, 청소법까지!) (1) | 2022.03.28 |
| [실험 정보] 작은 유전 물질이 어떻게 증폭되는거야? PCR 원리 (2) | 2022.03.27 |