[실험 정보] Real-time PCR- Part 1 (실험의 특징과 SYBR Green원리)

 

안녕하세요 뚜동이에요~ PCR에 이어 realtime PCR에 대해 알아볼게요!

realtime PCR이 뭐냐! 

실시간으로 PCR시에 증폭되는 산물의 정량을 형광으로 확인하는 실험방법이랍니다.

 

우리가 PCR을 했을때 막 두개에서 네개 이렇게 늘어나잖아요 그 양을 확인하고 싶을때! 사용하죠

되게 민감하기에 실험자의 스킬에 따라 결과가 달라지지만 제기준 PCR후 영동해야하는 번거로움 없이 

한번에 증폭되는 걸 확인 할 수 있다는 점에서 realtime PCR에 대해 알아두면 좋을 것 같아요 

 

또 다양하게 쓰이는 분야가 많기때문에!!

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일단 먼저 realtime PCR은

1. 앞에서 언급했듯 민감해요!

이런 경우에 아주 소량의 DNA라도 증폭시킬 수 있죠 

 

2. 외부의 오염에 노출될 확률이 작아요

이 실험은 아무래도 실험 용액을 튜브에 넣은 후 뚜껑이 닫힌 채로 바로 기계안으로 들어가고

그후 분석은 뚜껑이 닫힌채로 분석되기 때문에 실험 용액을 튜브에 넣는 과정까지만 조심한다면

결과도 깔끔하게 딱 나올거에요!

 

3. 실시간으로 확인 가능해요

기존 Conventional PCR과 달리 전기영동이 필요하지 않고 또 화면으로 실시간 형광의 양을 학인할 수 있기때문에

실험이 잘되고 있는지 양은 어느정도인지 정량이 가능해요

 

 

이렇게 크게 세가지의 경우로 realtime PCR의 특징을 알아봤어요~

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자 그럼 Realtime PCR에 사용되는 대표적인 dye(형광물질)은 어떤게 있을까요?

대표적으로는

1. SYBR Green
2. Taqman Probe가 있어요

 

Rrealtime PCR은 중요한 만큼 파트를 세가지로 나눠서 포스팅해볼게요

첫번째! SYBR Green 

두번째! Taqman Probe

세번째! 그래프 분석하는 방법

이렇게  순서를 나눠봤어요

 

그 이유는 일단 실험이 어떤건지, 거기에 사용되는건 뭔지에 대한 이해를 바탕으로 분석법을 배우는것이

실험의 성공유무를 판단할 수 있을 뿐아니라 분석이 가능해질 거라고 생각하기 때문이에요 

 

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그럼 오늘은 첫번째인 SYBR Green에 대해 조금 자세히 알아볼게요

SYBR Green은 한마디로 DNA에 붙어 착색시키는 염색시료에요

 

기본적으로 원리는 기본 Conventional PCR과 동일하기 때문에 혹시 헷갈리시면 제 글에 PCR 부분 보시는 걸 추천합니다!

 

그럼 대체 언제 이 형광 Dye가 DNA에 붙냐하면! 바로 Extention단계에서 SYBR Green이 이중결합사이에 붙게 돼요.

간단하게 얘기하면 DNA가 증폭하기위해 이중결합을 단일결합으로 분리시키고 그 과정에서 프라이머가 붙어서 신장이 일어나게되잖아요

그 과정에서 Double strand가 되면 그 사이를 SYBR Green이 붙게 되는거죠

 

하지만 이 SYBR Green의 경우에는 모든 DNA사이에 들어가기 때문에 정확하게 우리가 원하는 target DNA의 양만 확인할 수 없는 단점이 있어요

모든 DNA라 함은 프라이머의 dimer도 해당될 수 있고 비특이적으로 증폭된 DNA일 수 있죠

이를 확인하기 위해 바로 Melting curve단계를 추가해요

Melting curve는 PCR이 모두 완료된 후 진행되고 다시 온도를 서서히 올리면서 Denaturation 시켜주는 단계에요

자 이렇게 되면 형광dye인 SYBR Green은 어떻게 될까요?

double strand DNA가 Single strand DNA로 되면서 사이에 붙어있던 형광이 떨어지게 되요

앗 그럼 형광의 양이 점점 시간이 지나면서 감소하는 그래프로 나타나게 되겠죠?

이로써 비특이적으로 증폭된 DNA가 있는지 확인할 수 있어요

 

realtime PCR을 하게 되면~

아래의 그림처럼 DNA double strand에 따라 형광이 붙을때 발광하면서 저렇게 화면에 우상향 곡선커브를 나타내요

그냥 눈에 익혀두시고 나중에 분석할때 자세히 알려드릴게요!

그 후, Melting curve단계를 거치면

이렇게 감소하는 형태의 그래프를 확인할 수 있게 되죠

 

전체적인거만 알고 계시면 반은 왔어요!

실험실에서 주로 사용하는건 SYBR Green이니 잘 알아두시면 좋을 것 같네용 

 

여기까지 읽어주셔서 감사하고 다음 포스팅은 제 2탄 Taqman Probe에 대해 알아보겠습니다.

감사합니다~

 

출처: https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction