[실험 정보] Real-time PCR- Part 2 (Taqman probe 원리, SYBR green과의 차이점, 디자인시 주의사항)

안녕하세요 뚜동이에요!

지난시간에 이어서! 오늘은 real-time PCR의 두번째 이야기 Taqman probe에 대해 알아 볼게요

Taqman probe란 프라이머와 비슷한 성격을 가지고 있답니다. 

하지만 일반 primer과 다르게 5'과 3'의 양 말단에 reporter과 quencher라는 물질을 달고 있죠

primer의 5' 말단에는 형광 발현을 하는 reporter과 3'에는 소광제라는 quencher가 위치하고 있어요 

즉,  quencher라는 소광제가 reporter에서 나오는 빛을 흡수하여 다른 에너지로 바꿔버리는 거죠.

그만큼 reporter가 quencher근처에 있다면 우리는 형광을 보지 못하게 됩니당.

probe의 구성에 대해 알았다면 이제 실제 PCR에서 어떻게 작용하는 지 한번 알아볼까요?

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아래 출처 참고

위의 그림을 보면 서 하나하나 이해하시면 더 좋을 것 같아요! 차근차근 읽으면서 그림보면서 해보자구요 ㅎㅎ

 

 

이제 과정에 대해 알아볼게요!

1. PCR과정에서 온도를 높여 dsDNA를 ssDNA로 가닥을 분리해준 후, 온도를 낮춰 primer가 가닥에 달라 붙을 수 있게 해줍니다.

 

2. 그렇게 되면 이제 프라이머 (forward, reverse primer)와 우리의 taqman probe가 가닥에 붙게 되죵

 

3. 그 후, DNA polymerase가 붙고 primer가 결합된 부분부터 쭉 이중가닥으로 신장하게 되요 

 

4. 막 상보적인 가닥을 붙이고 있는데! 그러다가 이 taqman probe를 만나게 되면, 무시하고 계속 신장을 이어나갑니다. 

가닥을 만들어내는데 taqman probe는 어떠한 영향도 주지 않아요 걱정 노노!

 

그 이유는! DNA polymerase가 5'-> 3' exonuclease활성을 가지고 있어서 즉 핵산 말단 분해효소를 가지고 있기때문에 이 prob들을 제거시켜버리기 때문이죠!

 

그럼 이 taqman probe는 어떻게 될까요?

 

5. 여기서 5'말단의 reporter가 quencher와 붙어있던 probe에서 떨어지게됩니다.

 

앗 그렇게 되면 quencher와 멀어지게 되겠죠?

 

6. 그렇게 되면 저희가 이제 눈으로 형광 peak를 볼 수 있게 되는 거죠!

그리구 cycle이 늘어나면 늘어날수록 형광은 증가하게 됩니다.

 

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이쯤되면 sybr green과 taqman probe의 원리를 조금 이해하셨을까요?

제일 큰 차이는 특이적인가 아닌가의 차이입니다.- SYBR green은 증폭되는 모든 pcr산물에 대한 형광을 볼 수 있어서 타겟하는 것이 아닌 다른 물질도 형광이 나타날 수 있어요- Taqman probe는 타겟하는 서열에 붙어있다가 상보적 가닥이 만들어지면서 형광을 나타내기 때문에 SYBR Green보다 더 특이적인 반응을 이끌어 낼 수 있죠

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자, 그럼 reporter의 종류는 어떻게 될까요?

우리는 그냥 reporter 하나만 쓰는 걸까요?그 답은 no! 입니다.

 

우리는 많은 색의 형광을 나타내는 reporter를 접하실 수 있어요.다른말로 형광의 파장에 따라 결과를 산출해 내는 real-time PCR를 이용하기 위해서 다양한 파장대의 dye를 사용하면 되는 거죠아래는 dye의 종류들입니다! 참고하시구 겹치지 않게 probe를 디자인해주시는게 중요하겠죠?

아래 출처 참고

 

 

주의!!

reporter로 사용하는 dye는 회사마다 종류가 다양하기 때문에 probe 디자인시에 원하는 dye를 사용가능한지 미리 파악하고 디자인을 진행해주셔야 해요!

 

 

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여기까지 봐주셔서 감사하구 다음시간에는 real-time PCR을 통해 나온 결과들을 해석하는 시간을 가져보도록 할게요!이상 뚜동이의 실험 정보였습니다~

 

 

 

 

 

출처: https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/how-taqman-assays-work.html

TaqMan 어세이 원리 | Thermo Fisher Scientific - KR

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Real time PCR 의 형광 물질의 종류