[실험 정보] 전기영동에 대한 궁금증은 이걸로 종결시켜! Part 2

안녕하세요 뚜동이에요!!
전기영동기계의 구성은 어떻게 되어있는가라는 이전 포스팅에 이어!
Part 2!!
전기영동을 하기 위해 필요한 기구나 시약은 어떤게 있는가에 대해 알아볼게요

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전기영동을 하기 위해서는 필요한 시약들이 몇가지 있어요
바로바로
1. TAE 또는 TBE buffer
2. loading dye
3. DNA Ladder

4. EtBr

5. Agarose gel 입니다

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TAE Buffer
Tris 염기, Acetate 및 EDTA로 구성된 완충액

Tris는 양이온을 공급하는 역할을 해요

그래서 DNA를 잡아서 음극에서 양극으로 이동시킬 수 있게 되는 거죠

하지만 Tris는 PH가 거의 11에 가까운 염기이기 때문에 DNA의 해리가 일어날 수 있어요

즉, DNA의 denaturation이 일어나는 것이죠그래서 Acetate를 첨가해서 PH를 낮출 수 있게 된답니다.

EDTA를 추가로 넣어주는 이유는 DNA 분해효소와 같은 효소들의 작용을 일어나지 못하게 해줘서 DNA가 분해 되지 않도록 해주는 역할을 해요 따라서 DNA를 안정화시킬수 있죠

 

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 TBE buffer
Tris 염기, Borate 및 EDTA로 구성된 완충액

Tris 와 EDTA가 들어가는 건 동일하지만 아세트산 대신 Borate 들어갑니다.

 

둘다 전기영동에서 사용되는 buffer입니다.이 두가지 용액의 차이점은!TAE는 보통 분자량이 큰 DNA를 이용할때 주로 사용하고 TBE는 분자량이 작은 경우 사용해요plasmid DNA를 사용하는 실험실에서는 TAE를 , PCR을 주로 하는 경우 TBE를 사용한답니다. 즉, 작은 사이즈의 DNA를 내릴 경우에 TBE를 쓰게 된다면 보다 날렵하고 선명한 밴드를 확인하 실 수 있어요.

또는 사이즈가 비슷한 경우에도 TBE를 사용한다면 보다 명확한 분리가 가능하게 되겠죠.

자, TAE buffer와 TBE buffer를 어떨때 각각 사용하는지 이제 알겠죠?

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Loading dye

두번째 loading dye는 염료입니다.

눈에 보이지 않는 DNA이 어느정도까지 내려가고있는지 확인할 수 있다고 생각하면 쉽게 이해되실거에요

즉, DNA자체를 염색시키는 것이 아닌 DNA와 같이 내려지기때문에 이동위치를 파악할 수 있는 것이죠

Loading dye에는 bromophenol blue, xylene cyanol, glycerol등으로 구성되어있어요

bromophenol blue, xylene cyanol의 경우 사이즈에 따른 색을 겔상에서 보여주고

glycerol의 경우 DNA가 흩어지지 않고 Comb안에 가라앉을 수 있게 해준답니다. 

 

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DNA ladder

DNA ladder는 우리가 확인하고 싶은 DNA의 사이즈가 얼마나 되는지 확인할 수 있도록 함께 내려주는 표지자에요

따라서 회사마다 다양한 사이즈의 ladder를 팔고있죠

marker라고도 불리는 ladder는 전기영동시에 필수로 추가해줘야 해요!! 잊는다면 다시 내려야하는 대참사가ㅜㅜ

우리가 원하는 사이즈의 DNA가 있는지 확인이 필수이기때문에 꼭 잊지말고 같이 내려주기!

 

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EtBr

EtBr은 DNA 이중가닥의 사이로 들어가며 UV로 봤을때 500-590nm에서 최대의 형광을 나타내게 되어 DNA밴드를 확인할 수 있어요

EtBr의 경우 UV를 이용하기에 실험자에게도 좋지않고 DNA에게도 좋지않기 때문에 요즘은 대체 시약을 사용한답니다.

하지만 일부 실험실에서는 아직 EtBr을 사용하기도해요!

 

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그리고 가장 중요한 겔 만드는 법!!

Agarose를 사용해서 gel을 만들면 되고 gel의 농도는 실험의 필요에 따라 달라집니다.

Aagarose의 농도를 높이면 그만큼 촘촘하게 겔이 만들어지게 됩니다. 그러면 DNA또한 빠르게 이동할 수 없게되죠 

이를 파악하고 실험에 따라 겔 농도를 조절해주는게 중요해요

Gel 만들때는 agarose powder과 TAE 또는 TBE buffer를 이용하여 제작하면 됩니다.

 

순서

1. 농도에 맞게 agarose 와 TAE 또는 TBE buffer를 비커에 넣는다.

2. 전자렌지에 돌려 agarose를 녹여준다.

3. 조금 식힌 후, EtBr을 넣어준다.

4. gel tray에 부어준다.

 

전기영동시에 겔의 농도에 따라 DNA이동에 영향을 주기도 하지만 DNA의 형태나 크기, 완충용액의 조성이나 전류의 세기도 영향을 준답니다. 그리고 앞서 EtBr이 첨가된다면 DNA사이에 들어가기 때문에 15%가까이 이동속도가 느려진다고 해요

 

 

오늘은 전기영동을 하기위해 필요한 시약들을 알아봤어요 

다음은 전기영동시에 주의해야할 점이나 꿀팁들 그리고 결과 해석하는 법에 대해 포스팅해볼게요

 

끝까지 읽어주셔서 감사합니다~