안녕하세요 뚜동이에요!
앞의 part1, part2에서는 전기영동에 대한 기본적인 정의와 필요한 기구 및 시약들에 대해 알아봤어요
오늘은 전기영동의 마지막 시간!
방법의 과정에서 주의해야할 점과 꿀팁 그리고 결과 해석방법과
종종 나타나는 문제들의 경우까지 알아보고 마무리 하려고 합니다.
전기영동이 되게 간단한 실험이지만 그만큼 자주해야하는 실험이니
오늘 이 글을 마지막으로 마스터 하셨으면 좋겠습니당 ㅎㅎ
모든걸 쓴다고 하는데 자꾸 다쓰고 나면 이것도 적을걸 저것도 적을걸 하게 되더라구요 ㅜ
오늘은 그런 후회없게 열심히 써보겠습니다!
전기영동 방법
1. 굳힌 겔이 담긴 tray를 caster과 분리한 후, tank에 넣어줍니다.
2. 1X TAE 또는 1X TBE buffer를 tank에 부어 gel이 모두 잠기게 해줍니다.
여기서 DW를 넣으면 안돼요! 주의주의!
3. 피펫을 이용해서 DNA ladder를 comb에 넣어줍니다.
4. DNA또는 PCR product에 loading dye를 넣어줍니다.
dye에 따라서 희석해서 쓰는 양이 다르기때문에 몇배로 농축되어있는지 확인 하신 후, 섞어주세요
예를들어 6X Loading dye를 이용해서 DNA를 내리려고 한다면 DNA 5ul, loading dye 1ul을 섞어주시면 됩니다.
5. comb에 섞은 mixture을 넣어줍니다.
6. 뚜껑을 닫고 전기영동을 시작합니다.
7. DNA 사이즈, 전류의 세기에 따라 전기영동의 시간이 달라지므로 DNA가 내려오는 속도에 따라 영동확인 시간을 정하시면 됩니다.
여기서 꿀팁!
Comb에 mixture를 넣을때 수전증 장난아니잖아요 그때는 피펫잡고 있는 손을 반대쪽 손으로 피펫 몸통(팁 X)살짝 잡고 하시면 흔들리는 걸 조금 방지할 수 있어요
아니면 피펫을 잡은 손 측면을 로딩하는 tank 끝에 살짝 대고 실험해주시면 됩니당ㅎㅎ
그리고 주의사항!
1. 혹시 피펫안에 있는 mixture를 comb안으로 빠르게 내보낸다면 mixture가 가라앉지 못하고 밖으로 빠져나와버리기때문에 천천히 내려주셔야 합니다.
결과해석
자, 이제 결과를 해석하는 방법을 알아볼게요
여기 그림을 보시면, 제일 먼저 확인가능한건 DNA ladder가 양쪽 끝에 이쁘게 내려가 있는게 보이실 거에요
그다음 이제 결과를 해석해봅시다
결과를 보시면 뭔가 느낌이 오시나요 맞습니다.
1-3번, 4-6번, 7-9번, 10-12번이 사이즈가 같은 샘플들입니다.
DNA가 선형인지 supercolied인지에따라 사이즈를 살짝씩 다르게 판단해야하지만
지금은 그런 걸 생각하지 않고 결과를 해석해볼게요
해석1.
먼저! 1번부터 3번까지의 샘플은 4-500 bp대의 사이즈의 DNA인걸 볼수 있어요.
다음은 4-6번의 경우 3-400대, 7-9번의 경우 약 150-200대, 10-12번의 경우 200-300대로 판단할 수 있어요
해석2.
9번과 12번의 경우 희미한 밴드를 확인할 수 있어요
이는 Loading된 DNA의 양이 작아서 희미하게 밴드가 나온 것입니다.
해석3.
4와 5번 샘플의 경우 타겟하는 밴드 이외에 살짝 아래쪽에 희미한 밴드가 있는게 보이죠
이건 프라이머가 다른 부위에 붙어서 타겟하는 밴드이외의 비특이적인 밴드라고 생각하시면 됩니다.
PCR이란게 프라이머가 딱 이곳에 붙어! 한다고 붙는게 아니기 때문에 생길 수 있는 현상입니다.
이러한 경우에는 프라이머를 디자인시 비특이적인 밴드가 덜 생길 수 있도록 디자인하는 것이 관건이겠죠.
해석4.
하지만 3, 6번은 loading이 되지 않았네요. PCR이 잘 되지 않았을 확률이 높아요.
그 이유는 3번 맨아래에 보이는 희미한 선이 보이시나요 150bp밑에요!
저 부분을 dimer라고 하는데 PCR후에 남는 프라이머끼리 결합하거나 그런 경우때문에 생기는 밴드에요.
전기영동 과정에서 생길 수 있는 문제들과 Trouble shooting!
Q. 밴드가 흐려서 정확한 밴드를 볼수가 없어요
A. 전류가 너무 강한 경우 밴드가 흐리게 보일 수 있으니 전류의 세기를 조금 줄여서 다시 loading해보시면 이전보다 선명한 밴드를 확인하실 수 있을거에요
Q. DNA가 너무 두꺼워서 정확하게 사이즈 측정이 어려워요
A. 정기영동을 통해 정확한 사이즈를 알 수 있는건 아닙니다. 대략적으로 몇 bp인지 파악할 수 있죠. 만약 사이즈가 두꺼워서 정확한 사이즈를 확인할 수 없다면 DNA의 양이 많지는 않은지 농도를 한번 재보시는것을 추천합니다. DNA양을 조금 적게 loading해보세요.
Q. 전기영동하는데 기포가 많이 나요/ 전기영동시에 DNA가 더 빨리 내려가요
A. 이 경우 영동을 여러번 했을때 기포가 많이 나오기도 해요 이때는 buffer가 많이 희석되서 그런것!
전기영동시 tank안의 buffer와 gel의 buffer의 퍼센트가 같아야 해요
만약 DNA가 더 빨리 내려간다면 이 이유도 너무 많이 희석되서 그런것일 수 있어요
Q. 밴드가 쭈욱 끌리는 현상이 있어요
A. 여러 이유가 있지만 핵산을 추출할때 핵산들이 깨진경우 이러한 현상이 있을 수 있어요
또한, 실험시에 샘플의 오염, DNase 또는 RNase의 유입으로도 끌릴 수 있어요
물론 PCR시에 annealing의 온도가 적절하지 않은 경우도 생각해봐야 합니당!
이렇게 대표적인 문제점들과 해결방안도 알아봤어요
전기영동은 Part3로 마무리하려고 해요~ 다들 도움이 됐으면 좋겠습니다아!
긴글 읽어주셔서 감사합니다~
'실험 정보' 카테고리의 다른 글
| [실험 정보] 자주 쓰는 수학, 과학, 특수 기호 모음 (6) | 2022.05.13 |
|---|---|
| [실험 정보] PH 측정의 원리, 방법, 주의사항 (6) | 2022.04.29 |
| [실험 정보] 전기영동에 대한 궁금증은 이걸로 종결시켜! Part 2 (26) | 2022.04.18 |
| [실험 정보] 전기영동에 대한 궁금증은 이걸로 종결시켜! Part 1 (34) | 2022.04.17 |
| [실험 정보] Real-time PCR- Part 2 (Taqman probe 원리, SYBR green과의 차이점, 디자인시 주의사항) (0) | 2022.04.16 |