[실험 정보] 세포 동결보존(Cell Freezing)준비물, 실험방법, 주의사항

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안녕하세요 오늘은 세포배양 후 어떻게 보존을 하는지에 대해 알아보도록 할게요. 배지를 이용하여 세포를 많이 생산한 다음 해주어야 하는단계죠. 세포를 배양하는 만큼 보관하는 것도 중요하답니다. 잘못 동결했을 시 나중에 stock을 디프리저에서 꺼내게 다시 세포를 배양하였을때 자라지 않는 상황이 발생할 수 있답니다. 

그만큼 이 과정도 조심히 진행해주어야 합니다. 그럼 준비물은 어떤게 있는지 한번 알아보도록 하겠습니다.

 

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들어가기에 앞서 동결보존을 하는이유

세포를 계속 배양하면 되지 왜 보존을 하는지 의문이 생기실 수 있는데요. 세포를 배양하다보면 주변환경 또는 배양과정에의 오염으로 인해 세포들의 성질이 변하는 경우가 있어요. 그렇기 때문에 passage를 적게 진행한 세포를 사용해서 실험을 진행해주어야 한답니다. 그렇기 위해선 동결보존이 필수겠죠!

 

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1. 준비물

•  Cryogenic tube
• 동결보존하고자 하는 세포
• 10% DMSO
• Freezing container

 

2. 실험방법

1. 동결보존할 세포를 준비해줍니다.
2. 세포의 배지를 제거해준 후, PBS Washing을 진행해줘요. 앞서 말씀드렸으니 안보신분들은 앞전 포스팅을 참고해주세요.
3. 그 후, PBS를 제거해주고 세포를 배양 dish에서 떨어질 수 있도록 Trypsin-EDTA를 넣어줍니다. 이때 EDTA의 역할은 금속이온을 끌어당기는 역할을 하고 Trypsin의 경우 펩타이드 결합을 끊어주는 역할을 해요.  
4. 세포가 dish에서 떨어지면 배지를 넣어준 후, 원심분리를 진행합니다.
5. 그 다음 펠렛만 남겨두고 배지와 trypsin-EDTA가 섞인 용액을 제거해줘요.
6. 그 다음 Cell counting(이전글 확인!) 을 진행하여 세포를 얼마나 stock으로 만들어줄지 선택합니다. 양이 너무 작으면 나중에 stock을 풀때 세포가 잘 자라지 않을 수 있기때문에 적정량을 만들어주는것이좋아요. 세포는 주위의 다른 세포에도 영향을 받기때문입니다. 이때 기존 subculture과 달리 항생제가 들어가지 않은 FBS+DMEM(세포배양에 사용하는 배지)를 이용해줍니다.
7. 원하는 세포의 양에 맞게 추가 배지를 넣어준 후, 10% DMSO를 넣어줍니다. 
8. Cryogenic tube에 세포를 넣어줍니다. 
9. 세포양, 배지, 날짜, 세포명등을 기입해준 후, Freezing container에 넣어 하루동안 -78도 디프리저에 보관해줍니다.
10. 그 후, 액체질소에 보관해줍니다.

 

3. 주의사항 및 궁금증

Freezing container 사용하는 이유

1. 세포를 급격히 얼리게 되면 세포가 터질 수 있어요 세포의 생존을 위해 1분에 1도씩 내리면서 세포를 얼려주어야 한답니다. 그래서 Freezing container를 사용해주어야 해요.

* 주의사항: 이 container사용시 꼭 isopropanol이 채워져 있는지도 꼭 확인해주어야 합니다. 

 

2. cell stock제작시 cryogenic tube에 가득 담지 않아야 합니다. 

 

이상 세포 동결보존에 대한 내용이었습니다~