[실험 정보] Real-time PCR 용어 정리(feat. 실험 안될 때 해결 방법)

realtime pcr 용어 trouble shooting

Real time PCR  정의

• Real-time PCR: Real-time PCR은 DNA 증폭이 가능하며 실시간으로 증폭유무를 확인할 수 있는 실험방법 중 하나예요! 보통 기본적인 PCR 방법보다 조금 더 빠르게 결과를 확인할 수 있을 뿐 아니라 전기영동이라는 실험을 하지 않아도 결과 해석이 가능하죠
• 물론 전기영동으로 결과를 확인하고 싶은 경우 real-time PCR로 증폭된 PCR Product를 겔에 내려도 동일한 PCR방법이기에 겔상에서 당연히 확인됩니다! 만약 내가 엄청 미량의 샘플을 가지고 있다면 일반 PCR 방법으로는 증폭되어도 겔상에서 확인이 되지 않을 가능성이 있기 때문에 이 경우에는 real-time PCR을 수행하는 것이 효율적이랍니다.

Real time PCR 용어 정리

앞서 Realtime PCR에 대한 정보를 포스팅했었는데요 오늘은 용어 정리편입니다! 각 용어의 쓰임을 알고 실험을 진행한다면 보다 결과 해석하는데 도움이 되실 거예요.

1. Fluorescent probe:  용어 그대로 형광을 방출하는 염료를 말해요.  TaqMan probe, 분자 비콘, Scorpion 프라이머 및 SYBR Green을 포함하여 Real-Time PCR에 일반적으로 사용되는 여러 유형의 형광 프로브가 있어요.

 

2. Taqman Probe: 형광 probe 종류 중 하나로 PCR 증폭하는 동안 Taq 중합효소에 의해 절단될 때 형광을 방출한답니다.

 

3. SYBR Green: SYBR Green은 일반적으로 가장 많이 사용하는 probe중 하나예요. PCR 증폭 시 이중가닥 DNA에 인터칼레이션(intercalate)되어 결합 시 형광을 발산하는 형광염료로 서열 특이성에 관계없이 반응에서 이중 가닥 DNA를 검출할 수 있어요. 이는 표적 DNA의 정량화를 방해할 수 있는 비특이적 증폭 또는 프라이머 다이머의 존재가 있는 경우 단점이 될 수 있답니다. 

만약 비특이적 증폭이 발생한다면, 증폭이 되지 않는다면 해결할 수 있는 방법은 어떤것이 있을까요?

• 우선 프라이머의 양을 줄여보세요. 프라이머 다이머를 줄여줄 수 있어요
• 비특이적으로 피크가 나타난다면 타겟하는 DNA 염기서열과 Primer간의 서열을 확인해보세요.  다른 곳에 붙지는 않는지 프라이머 디자인 또는 참고한 논문이 본인의 실험에 잘 맞는지 확인하는 건 간과할 수 있으나 꼭 필요한 부분이랍니다.
• 비특이적 증폭이나 프라이머 dimer가 생기는 이유는 혹시 실험과정에서의 오염이 있었을 가능성도 있어요
• 혹시 아예 증폭이 일어나지 않는다면 이는 probe의 효율이 떨어진 것을 사용하지 않았는지 또 extension이 충분한지를 파악해야 합니다. 보통 제품에 따라 annealing과 extension을 한 번에 하는 경우가 있으나 제품의 trouble shooting을 참고해 보세요 거기에서 증폭의 효율을 높이는 방법 중 하나가 extension을 따로 주는 경우가 있더라구요. 여러분이 사용하는 제품의 매뉴얼에 있는 해결방법을 참고하시면 좋을 듯해요

중간에 다른 길로 빠져버렸네요 ㅎㅎ 다시 돌아와서 용어 정리 추가로 들어갑니다.

 

4. Threshold cycle (Ct): 중요한 용어니 꼭 알아두셔야 합니다. 샘플에서 표적 DNA의 초기 양을 계산하는 데 사용되는 값으로 형광신호가 특정 임계값 수준을 초과할 때의 PCR cycle 수예요. 그렇다면 Cq는 뭐야 하실 수 있는데요 정량화 주기(Cq):라고도 하며 Ct의 동의어입니다.

Ct 값 조금 더 자세히!

Real time PCR 결과를 확인할 때 가장 먼저 확인해야 하는 것 중 하나가 Ct값이에요. Ct 값은 샘플 즉 PCR Product안의 DNA 초기의 양에 반비례해요. 이 말이 무슨 말인가 하면 표적 DNA의 초기 양이 많으면 Ct값이 낮게  나타나요. 증폭될 DNA가 많으니 형광도 많이 나타나게 된답니다. PCR 사이클 수가 적어도 증폭이 많은 거죠! 그래서 real time PCR의 Ct값으로 실험하는 샘플의 대략적인 양도 비교가 가능하죠 a 샘플과 b샘플이 있는데 a가 Ct값이 b보다 더 낮다 하면 a가 우리가 타깃 하는 유전자가 더 많이 들어있다고 생각할 수 있죠.

 

Ct값은 PCR 반응의 효율성, 시작 샘플의 품질이나 양 등 다양한 요인의 영향을 받기 쉽기에 PCR시에는 조건 및 조성등을 최적화하는 것이 좋아요. 저 같은 경우에는 Ct값을 우선 확인하고 (1 반복) 그 후 본실험으로 3 반복을 진행해요. probe 가 비싸기 때문에 실험이 안되는데 많이 사용하면 너무 아깝더라고요.

아! 또 생각난 Trouble shooting 방법이 있는데 당연한 사실이지만 positive control을 같이 거는 것입니다.  negative control은 당연히 걸어야 하는 거 아시죠? 프라이머 다이머, 오염등을 바로 확인할 수 있는 방법 중 하나니까 실험하실 때 꼭 같이 넣어주셔야 해요. 샘플 대신 pcr mix에 DW를 넣어주시면 된답니다. 그럼 샘플 이외의 다른 조성물들이 들어가고 그중 오염이 있다면 음성 대조군에서 피크가 나타나며 증폭되겠죠? positive control은 beta actin GAPDH 등 House keeping 프라이머를 넣어주면 됩니다. 무조건 증폭되어야 하는 레퍼런스 프라이머를 사용하면 샘플의 문제가 있는지 바로 확인할 수 있어요!

 

이렇게 realtime PCR의 용어에 대해 알아봤는데요. 해결방법 또 생각나는 게 있으면 바로 포스팅하겠습니다. 글재주가 없어서 두서없이 쓴 거 같은데 이해 부탁드려요. 긴 글 읽어주셔서 감사합니다!